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東富龍之關于層析柱柱效的那些事

前    言
       在目前的生物制藥行業,絕大多數的分離純化,都會應用到層析技術,當然目前化藥、中藥提取、化妝品、甚至食品行業也會應用到層析技術。涉及到層析技術就涉及硬件設備裝填介質后應用于生產,但可用于生產的前提或者說是標準,需要一個衡量指標來衡量裝柱效果,這個衡量標準就是我們本文要提到的“柱效”,當然不止柱效一個參數,還包括對稱性,拖尾因子等。這些參數都將在測量柱效時一同處理。
       理論塔板數N,色譜的柱效參數之一,(簡稱柱效)。N取決于固定相的種類、性質(粒度、粒徑分布等)、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質的性質。
       測量柱效需盡量滿足理論條件,才可更接近實際值。

  柱效測定的理論基礎
柱效的計算公式:
理論塔板數N=5.54×(t/W1/2)2
對稱性Af=b/a  
其中:
N:       當前柱高的理論塔板數
t:    保留時間
W1/2:    半峰寬
Af:    對稱性
a:       延時間軸正向10%峰高處至100%峰高處時間
b:     延時間軸正向100%峰高處至10%峰高處時間

備注:通常有時還會有拖尾因子,實際生產時用的不多,對于一些檢驗用的層析柱
會要求拖尾因子在1-1.05,拖尾因子的計算方式時5%峰高處的a和b的比值。
當峰型符合正態分布時,采用該計算方式。





      理論塔板數:根據填料顆粒粒徑大小計算,在當前柱高的理論高度中,豎向堆積填料顆粒的理論數量。
      實際計算柱效為理論塔板數的1/2-1/3左右,沒有特殊說明默認為1米條件下。

             例如:DEAE 90um填料的理論塔板數應為
                       1m/90um=11111.11
                       11111.11×(1/2-1/3)=5555-3700

       所以實際柱效的理論值在3700-5555左右,實際值還會偏低一般在3000-5000左右,有時甚至更低。
       備注:通常DEAE用于生產時,并不看重柱效,實際2000左右時也會用于生產,除非是柱效對生產的結果影響較大時,會考慮柱效,并且高柱效并不是每次都可裝填出,設定標準是不建議定過高,避免影響生產。
       柱效:從名字上理解是層析柱的分離效果。層析柱柱的有效塔板數越大或有效的塔板高度越低,色譜柱的柱效越好,類似于每個塔板的分離效率相同,有效塔板數越多,最終得到的物質越純。柱效率是指溶質通過色譜柱之后其區域寬度增加了多少,它與溶質在兩相中的擴散及傳質情況有關,這是所謂色譜的動力學過程。根據塔板理論,可以計算一根色譜柱所達到的理論塔板數,或表達為每米理論塔板數n/m。顯然,N值越大,或H值越小,柱效越高。分散效果主要取決于所選擇的固定相。

測量柱效的方法

       前期準備:
                       準備好測試溶劑及測試樣品
                       具備紫外檢測器或電導率檢測器的層析系統
                       樣品至進入柱內及從流動相出口至檢測器管路越短越好

       配置溶液:
                       目前絕大多數的測量樣品溶液,通常選用1%柱體積(以下簡稱CV)上樣量,1%的濃度(當柱直徑大于1000mm以上時包括1000mm可考慮2%的濃度,減少因管路過大而對樣品產生的稀釋)。

       樣品溶液及流動相溶液的選擇通常選用條件為:
● 填料耐受
● 設備耐受
● 填料不吸附
● 無作用力或作用力最小
● 黏度低

         填料耐受:所使用溶液不會破壞填料的結構及框架,否則高附加值的填料將浪費。
         設備耐受:所使用溶液同樣需被硬件設備耐受,以免破壞設備及影響測量結果。
         填料不吸附:使用溶液如含有填料可吸附物質,將影響柱效,所測量值偏離正常結果,或無法洗脫。
         無作用力或作用力小:盡量選擇和填料間無作用力或作用力低的溶液,減少影響因素,追求接近理論值。
         粘度低:黏度高的溶液會使運行時壓力過大,并且可能造成拖尾現象。

         下面列出目前通用的,主流的柱效測試溶液選擇:
         低壓填料(絕大多數軟膠,耐受3bar壓力)



90μm粒徑DEAE 


34μm粒徑S100

通常有兩種方式:
       丙酮法:用純化水做流動相平衡2CV以上,并且將紫外檢測器波長設定為254nm或280nm,并且平衡時基線穩定,1%丙酮做樣品做測試。
       NaCl法:以0.4MNaCl平衡2CV以上,并且電導率曲線趨于平穩,最好柱前與柱后都有電導率檢測器,前后一致及穩定后,2MNaCl上樣,測量柱效相對最好,但由于層析設備及層析柱絕大多數的不銹鋼材質都為316L,而316L不銹鋼對氯離子耐受能力為在2MNaCl下,25℃,可耐受1小時,處于耐受問題可選擇0.8MNaCl上樣或1.0MNaCl上樣。此方發較丙酮法的優點為NaCl更環保,不考慮有機溶劑處理及殘留的問題。缺點為必須平衡穩定后才可測量柱效,否則峰形不穩定。此方法測量的柱效/對稱性較丙酮偏低,物料損耗大。

B. 高壓填料(基本為反相填料)

通常有兩種方式:
● 萘-乙腈法:用100%乙腈做流動相平衡2CV以上,并且紫外在254nm處基線穩定,1%萘-乙腈溶液做樣品測試。
● 甲苯-乙腈法:用50%乙腈-水溶液做流動相平衡2CV以上,并且紫外在254nm處基線穩定,1%甲苯50%乙腈-水溶液做樣品測試。
上文說到的填料不耐受在此處有體現,大多數反相填料,無法耐受純水相,純水相會導致填料功能基團失效。

C.其他
 由于市面上的填料廠家過多,A與B中目前為主流測試方法,其他需根據填料生產廠家提供的測試方法。


量柱效的結果分析

1、峰型:




標準峰:符合正態分布可正常計算柱效,大多數峰均可計算柱效查看裝柱狀態是否良好,但雙峰或者多峰就無計算的必要,需查找原因重新測定或者重新裝柱。
● 駱駝峰:當前樣品出現兩次峰型,主要原因一般為填料在層析柱內部斷層,不均一,一般是由于裝柱時進氣,或者二次壓柱導致填料出現斷層。另一原因主要為填料過臟(主要為上層)或者柱頭有堵塞的情況。出現以上情況都需處理后,重新裝柱
● 拖尾峰與前傾峰:當Af>1時,我們稱作拖尾,拖尾為柱床壓的過松,當Af<1時我們稱作前傾,前傾為柱床壓的過緊。通常在0.9-1.3的范圍內我們認為良好對稱性,對于部分要去不高的甚至卡到0.8-1.5,就可滿足生產(因有時為第一步粗純,較好的對稱性的柱效有時效果不明顯(主要還是考慮到實際生產的便捷性),但總體上的效果還是柱效越高,對稱性越接近于1,效果越好。
● 矮胖峰:通常的主要原因為樣品進入柱子時被稀釋,選擇柱子進口上樣,如還存在問題,需重新裝柱,再次測量柱效。
● 毛刺峰:通常的主要原因為有細小氣泡伴隨樣品出現,排氣泡后再次測量,如效果不達標,需重新裝柱,裝柱過程中注意提前排氣泡,對填料進行更好的勻漿,將填料內部氣泡盡量排出。
● 漂移峰:通常的主要原因為為平衡好,基線不穩,重新平衡,平衡穩定后,再次測量柱效,結果不合格時重新裝柱。
● 階梯峰:通常的主要原因為有殘留死體積大導致,可能是由于密封圈使用錯誤導致,檢查密封圈使用的是否正確,并檢查是否有加大死體積部位,后重新測量,如結果不合格需重新裝柱。

2、出圖分析:
通常分析圖譜會基于兩個參數:
柱效與對稱性
● 柱效:柱效已經在上文中提過,計算方式基本通用于99%以上的填料,此方法計算的為大概數據,通常柱效會比計算值偏低,主要是由于填料粒徑的均一度,還有功能基團的大小所影響,導致實際測量效果會更低。
根據筆者的經驗之談,大多數DEAE柱效在3000左右時,就可以滿足生產,但也有藥品的生產需求高柱效。
● 對稱性:通常填料供應商給出的對稱性很寬泛,一般在0.8-1.8均認為合格,在早期的生產中,絕大多數也認為可行,但隨著行業發展目前對對稱性的要求越來越高,以目前的狀況來看對稱性在0.9-1.3之間,在生產上普遍認為可接受,在個別生產中要求在1.2以內,甚至1.1左右,這是對于生產來說,對于檢驗用的預裝色譜柱會要求在1.0左右,并且要求拖尾因子在1.0-1.05。
還有一點比較重要,就是不同供應商設備測量的柱效不一致,據筆者了解,差異很大,如實際用時,可采用手動作圖來驗證數據差異。
另外,裝柱時的壓力,流速,勻漿比,壓縮比需確定,這幾項參數對裝柱結果影響巨大,同時這些參數也需要根據填料的具體使用狀況做細微的變動。如填料使用多次后,有時需加大壓縮比來保證對稱性。


柱效測定實例







丙酮法測量90um填料柱效


NaCl法測試90um填料柱效


備注:兩者不是同一次裝柱測量   
       圖中的兩次為東富龍海崴的層析系統及層析柱實際裝柱測量的柱效,層析系統為20L/min流速的梯度層析系統,層析柱為ID600mm x 600mm自動低壓層析柱,兩圖的測量結果均滿足可實際生產的標準。
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